拟南芥AP3基因植物表达载体构建在烟草中遗传转化,本论文为免费优秀的关于拟南芥论文范文资料，可用于相关论文写作参考。
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摘 要：拟南芥花器官B类特征基因属于MADS-box基因家族,其中APETALA3（AP3）基因在花瓣和雄蕊中特异性地表达.为探讨AP3基因在花瓣和雄蕊发育中的功能,本研究从拟南芥（Arabidop.sis thaliana）花序中克隆AtAP3基因构建植物表达载体,并转化烟草（Nicotiana tobacum）.通过PCR及qRT-PCR分析,表明AtAP3基因成功转入烟草基因组并表达转录.表型观测显示转基因烟草雄蕊和野生型相比明显变短,说明AP3基因特异性地参和雄蕊的发育并起着至关重要的作用.
关键词：拟南芥；APETALA3（AP3）；转基因；烟草；雄蕊发育
中图分类号：S188+.1
文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）02-0007-05
花是被子植物的重要 官.花器官的发育模型最早源于Coen和Meverowitz对拟南芥和金鱼草的研究,并提出了花发育的“ABC”模型,随后该模型被后人逐步发展为“ABCD”或“ABCE”模型.典型的花发育具体可分为四轮,分别为萼片、花瓣、雄蕊和心皮,每一轮的发育都受相应基因的特异性调控.
隶属于MADS-box家族的植物花器官B类特征基因在雄蕊及花瓣发育中行使功能.研究表明,B类功能基因在花器官发育时和C类功能基因共同控制雄蕊发育,同时又和A类功能基因共同调控花瓣发育,当B类功能基因缺失,雄蕊会转化为心皮,花瓣则转化为萼片,形成只有心皮和萼片的不完整花器官.B类功能基因在植物进化过程中发生了两次基因重复事件,结果在这个亚家族中产生了四个不同的进化系,分别为DEF/AP3（paleoAP3）、GLO/PI、TM6和euAP3.其中拟南芥经历基因重复后,其B类功能基因产生了属于euAP3进化系成员的APETAIA3（AP3）基因和属于GLO/PI进化系成员的PISTELIATA（PI）基因.
目前对花器官发育的研究大多以“ABC”模型为理论基础来丰富其他物种的花器官发育机制,关于拟南芥AP3基因在烟草中异源表达的研究报道较少.本试验根据拟南芥B类功能基因的高度保守性及组织表达特异性,从拟南芥花序中克隆得到AtAP3基因,构建植物表达载体并进行烟草遗传转化.不仅对植物花器官B类特征基因AP3的功能进行了新的补充,还增加了对植物花发育“ABC”模型的新认识.
1 材料和方法
1.1 试验材料
野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana Col-0）、野生型烟草（Nicotiana tobacum）种子均为本实验室保存.
1.2 菌株及主要试剂
大肠杆菌Transl-T1感受态购自Transgen（中国）；农杆菌EHA105由本实验室保存；植物表达载体pROKII质粒,由山东师范大学张慧教授惠赠；质粒提取、胶回收试剂盒购自OMEGA公司（美国）；PCR相关试剂、DNA marker、限制性内切酶、T4 DNA ligase、PrimeScriptrrM RT reagent Kit购自TaKaRa公司（中国大连）；EasyPureTM PlantRNA Kit、pEASY-T1购自Transgen（中国）；其他试剂为进口或国产分析纯.
1.3 试验方法
1.3.1 拟南芥花序总RNA提取及AtAP3基因的克隆 用EasyPure"rM Plant RNA Kit试剂盒提取拟南芥花器官的总RNA,采用PrimeScriptTM RT rea-gent Kit试剂盒进行cDNA合成.以cDNA为模版,利用引物AtAP3-F和AtAP3-R（表1）进行PCR扩增.反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,共35个循环；72℃再延伸7min,PCR结束后全部产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析.利用凝胶回收试剂盒回收目的片段,将回收后的片段根据操作手册介绍方法连人pEASY-T1载体中,转化大肠杆菌Transl-T1感受态,涂LB抗性平板（卡那抗性）,对获得的单克隆进行菌落PCR验证,筛选后的阳性克隆命名为pEASY-T1-AtAP3,送至哈尔滨博仕生物技术有限公司测序.
1.3.2 植物表达载体构建利用限制性内切酶Xba I、Kpn I双酶切重组质粒pEASY-T1-A-tAP3,同时将pROKII载体质粒也用XbaI、Kpn I双酶切,并分别回收目的片段,利用T4 DNA ligase过夜连接转化大肠杆菌Transl-T1感受态,涂LB抗性平板（卡那抗性）,对获得的单克隆进行菌落PCR验证,筛选后的阳性克隆命名为pROKII-AtAP3,提取质粒,送至哈尔滨博仕生物技术有限公司测序.选取测序正确的质粒转化农杆菌EHA105,提取农杆菌中的质粒利用引物pROKII-F和pROKII-R（表1）进行PCR检测.
1.3.3 转基因株系获得及分子检测 通过根瘤农杆菌介导法进行烟草的遗传转化,转化过程如下：预培养1～2d；农杆菌（OD等于0.2）侵染3min；共培养1～2d；脱菌.一个月后获得抗性株系.用CTAB方法提取抗性植株的总DNA,利用引物pROKII-F和pROKII-R进行PCR,并用1%琼脂糖凝胶检测,分析是否成功获得转基因株系.
1.3.4 实时定量RT-PCR分析检测 用EasvPureTM Plant RNA Kit试剂盒提取转基因植株的总RNA,经反转录试剂盒进行cDNA合成.将合成的第一链cDNA加去离子水稀释10倍后作为模板,进行定量检测,引物为AtAP3-RT-F和AtAP3-RT-R（表1）.反应体系为20μL：其中2×SYBR Green实时荧光染料混合液10μL,ROXDye Ⅱ0.4μL,2μL cDNA模板,正、反向引物各0.8μL.以NtActin基因作为内参,扩增反应条件为：95℃30s；95℃5s,60℃35s,40个循环；95℃15s,60℃lmin,95℃15s.每个样品进行3次重复,并通过2-△△Ct法进行计算.
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