琯溪蜜柚CmPME1克隆其在果实发育过程中表达分析,本论文主要论述了琯溪蜜柚论文范文相关的参考文献,对您的论文写作有参考作用。
琯溪蜜柚论文参考文献：
摘 要 利用RT-PCR技术从‘琯溪蜜柚’中克隆得到1条PME（pectinmethylesterase）基因的ORF序列,命名为CmPME1.该序列编码一个含有582个氨基酸的蛋白质,分子量63.37 ku,该蛋白属于稳定的碱性亲水性蛋白.同源性分析表明：其编码的氨基酸序列和可可树（Theobroma cacao）、毛果杨（Populus trichocarpa）的同源性分别为76%、74%,和甜橙的氨基酸序列同源性高达99%.实时荧光定量PCR结果表明,随着果实的发育,CmPME1的表达量逐渐升高,在花后170 d达到最高,然后逐渐降低,远中柱汁胞CmPME1的表达量高于近中柱.
关键词 琯溪蜜柚；PME；克隆；实时荧光定量PCR
中图分类号 S813.3 文献标识码 A
琯溪蜜柚[Citrus maxima（Burm.） Merr.]果实存在汁胞粒化的生理病害, 表现为汁胞中柱和轴端汁胞异常膨大, 汁胞变硬、细胞壁加厚、木质纤维化、出汁率下降, 风味变淡.琯溪蜜柚果实汁胞粒化通常从囊瓣近蒂端汁胞发生, 后渐向果心发展, 其中以果心处长形汁胞粒化最为严重[1-3].据观察,琯溪蜜柚果实汁胞粒化发生在果实生长后期（一般为9月中下旬开始）,采后贮藏期间果实汁胞粒化进一步加重[2].有报道指出果胶甲酯酶和柑橘果实的粒化有关[4-5].
果胶甲酯酶（pectinmethylesterase,简称PME、PE, EC： 3. 1. 1. 11）广泛存在于植物以及一些细胞壁降解的微生物中[6].果胶甲酯酶能水解果胶生成果胶酸、甲醇、氢离子,进而导致果胶酸钙的形成[7-9].PME属于多基因家族,由于PME结构和表达模式的多样性,其作用也存在差异[10-11].植物中果胶甲酯酶在细胞壁降解[12-13],小孢子发生和花粉管发育[14-16],种子萌发[17],根尖延伸[18],果实的软化成熟[19]等方面起着重要作用.近几年来,在植物中有关PME基因的克隆和表达已有许多报道,已从草莓、烟草、白菜等植物中克隆得到果胶甲酯酶基因[20-22],认为该基因和果实衰老过程中结构变化、植物病毒之间存在相互作用、雄性不育等功能有关.此外,在柑橘汁胞和柑橘皮中也克隆得到了PME基因[23-24].
为从探明‘琯溪蜜柚’CmPME1在果实生长过程中表达水平变化和果实粒化的关系,本研究利用RT-PCR技术从‘琯溪蜜柚’汁胞中克隆得到CmPME1的ORF序列,并对其进行了生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术检测‘琯溪蜜柚’果实发育不同时期和不同部位的CmPME1的表达特性.
1 材料和方法
1.1 材料
本实验所用材料采自漳州市平和县小溪镇果园.采集时间为2013年7月16日至10月28日,约每隔10 d采集1次样品.取汁胞冻于液氮中,存放于-80 ℃.
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取、检测及cDNA第一链的合成
柚汁胞总RNA提取参照钟凤林等[25]的Trizol方法提取,紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度.按照Trans ScriptⅡFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒合成cDNA第一条链.
1.2.2 CmPME1基因ORF的克隆 采用Primer 5.0软件设计引物.根据甜橙基因组中PME中的cDNA序列,在起始*子和终止*子位置设计引物（见表1）,引物合成和测序均委托上海博尚生物技术有限公司完成.
以琯溪蜜柚汁胞cDNA为模板,进行PCR扩增.反应体系为25 μL,其中10×Ex-TaqBuffer 2.5 μL,dNTPs（10 mmol）0.5 μL,上下游引物（10 μmol）各0.5 μL,模板cDNA1 μL,Ex-Taq（5 U/μL）0.15 μL,加水至终体积25 μL.反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 45 s,58 ℃ 50 s,72 ℃ 2 min,35个循环；最后72 ℃再延伸10 min.PCR反应结束后电泳检测,将目的片段回收、连接、转化、测序.
1.2.3 CmPME1的荧光定量表达 实时荧光定量PCR引物的设计和合成：以‘琯溪蜜柚’Tubulin基因为内参基因,根据已克隆的CmPME1基因的ORF序列,按照标准荧光定量PCR引物原则设计引物（表2）.
用试剂盒的方法分别提取‘琯溪蜜柚’果实发育不同时期和不同部位汁胞的总RNA,每个样品进行3次生物重复,并以它们为模板,按照PrimeScript RT reagent kit（Perfect Real Time）试剂盒的方法合成cDNA第一链,-20 ℃保存备用.
荧光定量PCR在罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪上进行.将合成的cDNA（500 ng/μL）稀释10倍作为模板,进行荧光定量PCR.反应体系为20 μL：2×SYBR PremixEx TaqⅡ10 μL,上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL,cDNA模板1 μL,加ddH2O至终体积20 μL,每个样品进行3次技术重复.PCR反应程序采用两步法：95 ℃ 30 s（预变性过程）；95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40个循环（PCR反应过程）；95 ℃ 5 s,60 ℃ 1 min（熔解曲线分析过程）.根据荧光定量PCR目的基因CmPME1和内参基因β-Tubulin的Ct值,利用2-ΔΔCT（Livak）方法对果实发育不同时期和不同部位汁胞的CmPME1基因进行相对定量计算.
1.2.4 序列分析和生物信息学分析 采用ExPASy ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）进行蛋白质理化性质的分析；采用Tmpered（http：//www.ch.embnet.org/software/tepred-form.html）进行跨膜结构预测和分析；采用PSORT（http：//psort.nibb.ac.jp/）进行亚细胞定位预测和分析；利用Mega 5.22进行系统进化树分析.
结论：适合不知如何写琯溪蜜柚方面的相关专业大学硕士和本科毕业论文以及关于琯溪蜜柚苗论文开题报告范文和相关职称论文写作参考文献资料下载。
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